El ditiotreitol (DTT) és un agent reductor d'ús habitual, també conegut com el nou additiu verd.És un petit compost orgànic molecular amb dos grups mercaptans (-SH).A causa de les seves propietats reductores i estabilitat, la DTT s'utilitza àmpliament en experiments de bioquímica i biologia molecular.
El paper principal de la DTT és reduir els enllaços disulfur en proteïnes i altres biomolècules.L'enllaç disulfur és una part important del plegament i l'estabilitat de proteïnes, però en determinades condicions experimentals, com ara l'anàlisi SDS-PAGE reductible, la recombinació i el plegament de proteïnes, és necessari reduir l'enllaç disulfur a dos grups tiol per desentranyar l'estructura espacial de la proteïna.La DTT pot reaccionar amb enllaços disulfur per reduir-los a grups mercaptà, obrint així l'estructura espacial de la proteïna i facilitant-ne l'anàlisi i la manipulació.
La TDT també es pot utilitzar per protegir l'activitat i l'estabilitat de l'enzim.En algunes reaccions catalitzades per enzims, l'activitat de l'enzim pot ser reduïda per l'oxidant.El DTT pot reaccionar amb oxidants per reduir-los a substàncies inofensives, protegint així l'activitat i l'estabilitat de l'enzim.
En comparació amb els agents reductors tradicionals com el β-mercaptoetanol (β-ME), el DTT es considera un agent reductor més segur i estable.No només és estable en solució aquosa, sinó que també manté les seves propietats reductores en condicions d'alta temperatura i àcid-base.
L'ús de la TDT és relativament senzill.En general, la TDT es dissol en un tampó adequat i després s'afegeix al sistema experimental.La concentració òptima de TDT s'ha de determinar segons l'experiment específic i, generalment, s'utilitza en el rang de 0,1-1 mM.Concentracions més baixes poden reduir els efectes adversos sobre el creixement cel·lular i poden reduir la citotoxicitat a causa de la sobreexpressió de proteïnes diana.Les concentracions més altes poden causar una càrrega metabòlica cel·lular excessiva, afectant el creixement cel·lular i l'eficiència d'expressió.
La manera de determinar la concentració òptima pot ser avaluar el nivell d'expressió de la proteïna diana mitjançant la realització de proves d'inducció IPTG a diferents concentracions.Es poden realitzar proves de cultiu a petita escala utilitzant un rang de concentracions d'IPTG (per exemple, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, etc.) i l'efecte d'expressió a diferents concentracions es pot avaluar detectant el nivell d'expressió de la proteïna diana (per exemple, Western blot o detecció de fluorescència).Segons els resultats experimentals, es va seleccionar la concentració amb el millor efecte d'expressió com a concentració òptima.
A més, també podeu consultar la literatura rellevant o l'experiència d'altres laboratoris per entendre l'interval de concentració d'IPTG utilitzat habitualment en condicions experimentals similars, i després optimitzar i ajustar segons les necessitats experimentals.
És important tenir en compte que la concentració òptima pot variar en funció de diferents sistemes d'expressió, proteïnes diana i condicions experimentals, per la qual cosa és millor optimitzar-la cas per cas.
En resum, el DTT és un agent reductor d'ús habitual que es pot utilitzar per reduir els enllaços disulfur en proteïnes i altres biomolècules i per protegir l'activitat i l'estabilitat de l'enzim.S'ha utilitzat àmpliament en experiments de bioquímica i biologia molecular.
Hora de publicació: 28-set-2023