El ditiotreitol (DTT) és un agent reductor d'ús comú, també conegut com el nou additiu verd. És un compost orgànic molecular petit amb dos grups mercaptà (-SH). A causa de les seves propietats reductores i estabilitat, el DTT s'utilitza àmpliament en experiments de bioquímica i biologia molecular.
La funció principal del DTT és reduir els enllaços disulfur en proteïnes i altres biomolècules. L'enllaç disulfur és una part important del plegament i l'estabilitat de les proteïnes, però sota certes condicions experimentals, com ara l'anàlisi SDS-PAGE reduïble, la recombinació i el plegament de proteïnes, cal reduir l'enllaç disulfur a dos grups tiol per desentranyar l'estructura espacial de la proteïna. El DTT pot reaccionar amb els enllaços disulfur per reduir-los a grups mercaptà, obrint així l'estructura espacial de la proteïna i facilitant-ne l'anàlisi i la manipulació.
El DTT també es pot utilitzar per protegir l'activitat i l'estabilitat dels enzims. En algunes reaccions catalitzades per enzims, l'oxidant pot reduir l'activitat de l'enzim. El DTT pot reaccionar amb els oxidants per reduir-los a substàncies inofensives, protegint així l'activitat i l'estabilitat de l'enzim.
En comparació amb els agents reductors tradicionals com el β-mercaptoetanol (β-ME), el DTT es considera un agent reductor més segur i estable. No només és estable en solució aquosa, sinó que també manté les seves propietats reductores a altes temperatures i condicions àcid-base.
L'ús del DTT és relativament senzill. En general, el DTT es dissol en un tampó adequat i després s'afegeix al sistema experimental. La concentració òptima de DTT s'ha de determinar segons l'experiment específic i generalment s'utilitza en el rang de 0,1-1 mM. Concentracions més baixes poden reduir els efectes adversos sobre el creixement cel·lular i poden reduir la citotoxicitat a causa de la sobreexpressió de les proteïnes diana. Concentracions més altes poden causar una càrrega metabòlica cel·lular excessiva, afectant el creixement cel·lular i l'eficiència de l'expressió.
La manera de determinar la concentració òptima pot ser avaluar el nivell d'expressió de la proteïna diana realitzant proves d'inducció d'IPTG a diferents concentracions. Es poden realitzar proves de cultiu a petita escala utilitzant una gamma de concentracions d'IPTG (per exemple, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, etc.) i l'efecte d'expressió a diferents concentracions es pot avaluar detectant el nivell d'expressió de la proteïna diana (per exemple, Western blot o detecció de fluorescència). Segons els resultats experimentals, la concentració amb el millor efecte d'expressió es va seleccionar com a concentració òptima.
A més, també podeu consultar la literatura pertinent o l'experiència d'altres laboratoris per comprendre el rang de concentració d'IPTG que s'utilitza habitualment en condicions experimentals similars i, a continuació, optimitzar-lo i ajustar-lo segons les necessitats experimentals.
És important tenir en compte que la concentració òptima pot variar en funció dels diferents sistemes d'expressió, les proteïnes diana i les condicions experimentals, per la qual cosa és millor optimitzar-la cas per cas.
En resum, el DTT és un agent reductor d'ús comú que es pot utilitzar per reduir els enllaços disulfur en proteïnes i altres biomolècules i per protegir l'activitat i l'estabilitat dels enzims. S'ha utilitzat àmpliament en experiments de bioquímica i biologia molecular.
Data de publicació: 28 de setembre de 2023