L'IPTG (isopropil-β-D-tiogalactòsid) és un anàleg del substrat de la β-galactosidasa, que és altament induïble. Sota la inducció d'IPTG, l'inductor pot formar un complex amb la proteïna repressora, de manera que la conformació de la proteïna repressora canvia, de manera que no es pot combinar amb el gen diana i el gen diana s'expressa de manera eficient. Aleshores, com s'ha de determinar la concentració d'IPTG durant l'experiment? Com més gran, millor?
Primer, entenem el principi de la inducció IPTG: l'operó (element) de la lactosa d'E. coli conté tres gens estructurals, Z, Y i A, que codifiquen la β-galactosidasa, la permeasa i l'acetiltransferasa, respectivament. lacZ hidrolitza la lactosa en glucosa i galactosa, o en al·lo-lactosa; lacY permet que la lactosa de l'entorn passi a través de la membrana cel·lular i entri a la cèl·lula; lacA transfereix el grup acetil de l'acetil-CoA al β-galàctosid, cosa que implica eliminar l'efecte tòxic. A més, hi ha una seqüència operativa O, una seqüència inicial P i un gen regulador I. El gen I codifica una proteïna repressora que es pot unir a la posició O de la seqüència de l'operador, de manera que l'operó (meta) es reprimeix i es desactiva. També hi ha un lloc d'unió per a la proteïna activadora de gens catabòlics: el lloc d'unió CAP aigües amunt de la seqüència inicial P. La seqüència P, la seqüència O i el lloc d'unió CAP junts constitueixen la regió reguladora de l'operó lac. Els gens codificants dels tres enzims estan regulats per la mateixa regió reguladora per aconseguir l'expressió coordinada dels productes gènics.
En absència de lactosa, l'operó lac (meta) es troba en un estat de repressió. En aquest moment, el repressor lac expressat per la seqüència I sota el control de la seqüència promotora PI s'uneix a la seqüència O, cosa que impedeix que l'ARN polimerasa s'uneixi a la seqüència P i inhibeix la iniciació de la transcripció; quan hi ha lactosa, es pot induir l'operó lac (meta). En aquest sistema d'operó (meta), el veritable inductor no és la lactosa en si. La lactosa entra a la cèl·lula i és catalitzada per la β-galactosidasa per convertir-se en al·lolactosa. Aquesta última, com a molècula inductora, s'uneix a la proteïna repressora i canvia la conformació de la proteïna, cosa que condueix a la dissociació de la proteïna repressora de la seqüència O i la transcripció. L'isopropiltiogalactòsid (IPTG) té el mateix efecte que l'al·lolactosa. És un inductor molt potent, que no és metabolitzat pels bacteris i és molt estable, per la qual cosa s'utilitza àmpliament en laboratoris.
Com determinar la concentració òptima d'IPTG? Prenguem l'exemple d'E. coli.
La soca d'E. coli BL21 modificada genèticament que conté el pGEX recombinant positiu (CGRP/msCT) es va inocular en un medi líquid LB que contenia 50 μg·mL-1 Amp i es va cultivar durant la nit a 37 °C. El cultiu anterior es va inocular en 10 ampolles de 50 mL de medi líquid LB fresc que contenia 50 μg·mL-1 Amp en una proporció d'1:100 per al cultiu d'expansió, i quan el valor de OD600 era de 0,6 a 0,8, es va afegir IPTG a la concentració final. És 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Després de la inducció a la mateixa temperatura i al mateix temps, es va extreure 1 mL de la solució bacteriana i es van recollir les cèl·lules bacterianes per centrifugació i es van sotmetre a SDS-PAGE per analitzar la influència de diferents concentracions d'IPTG en l'expressió de proteïnes, i després seleccionar la concentració d'IPTG amb la major expressió de proteïnes.
Després dels experiments, es descobrirà que la concentració d'IPTG no és tan gran com sigui possible. Això és degut a que l'IPTG té una certa toxicitat per als bacteris. Superar la concentració també matarà la cèl·lula; i en general, esperem que com més proteïna soluble s'expressi a la cèl·lula, millor, però en molts casos quan la concentració d'IPTG és massa alta, es formarà una gran quantitat d'inclusions al cos, però la quantitat de proteïna soluble disminueix. Per tant, la concentració d'IPTG més adequada sovint no és com més gran millor, sinó com més baixa sigui la concentració.
L'objectiu de la inducció i el cultiu de soques modificades genèticament és augmentar el rendiment de la proteïna diana i reduir els costos. L'expressió del gen diana no només es veu afectada pels factors propis de la soca i el plasmidi d'expressió, sinó també per altres condicions externes, com ara la concentració de l'inductor, la temperatura d'inducció i el temps d'inducció. Per tant, en general, abans d'expressar i purificar una proteïna desconeguda, és millor estudiar el temps d'inducció, la temperatura i la concentració d'IPTG per tal de seleccionar les condicions adequades i obtenir els millors resultats experimentals.
Data de publicació: 31 de desembre de 2021